摘要：建立了毛細(xì)管電泳同時(shí)分離測(cè)定中藥石韋中綠原酸、槲皮素含量的分析方法．采用柱端噴壁式三電極系統(tǒng)的電化學(xué)檢測(cè)方式，工作電極為0．5 mm碳圓盤電極；參比電極為Ag／AgCl；輔助電極為鉑絲電極．以70cm（o．d.360μm，i．d．25μm）的熔融石英毛細(xì)管為分離通道，在*電泳介質(zhì)（pH=7.0，10.0mmol／L磷酸鹽緩沖溶液）中，當(dāng)分離電壓為21kV時(shí)，兩待測(cè)物質(zhì)在8min內(nèi)*分離．在*分離、檢測(cè)條件下，響應(yīng)電流與濃度之間的線性關(guān)系良好，綠原酸、槲皮素的線性方程分別為：y=0.268x+ 1.088、y=0.312x+ 0.822，相關(guān)系數(shù)大于0.999，綠原酸、槲皮素檢測(cè)限分別達(dá)0.075μg／mL和0.020μg／mL。該方法具有良好的重現(xiàn)性，峰電流的RSD小于3.5%。已成功的用于實(shí)際中藥石韋和模擬血樣中綠原酸、槲皮素的含量測(cè)定，結(jié)果令人滿意。
關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳；電化學(xué)檢測(cè)；綠原酸；槲皮素；石韋
天然植物石韋味苦、性微寒，歸肺、膀胱經(jīng)．具有利尿通淋，清熱止血的功效。綠原酸（Chlorogenic acid，簡(jiǎn)稱CGA）和槲皮素（Quercetin，簡(jiǎn)稱QC）是石韋中的主要指標(biāo)成分，綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能。槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗病毒、抗癌及抗糖尿病等作用。
已有報(bào)道用毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法測(cè)定了單組分的綠原酸以及混合物中的綠原酸。劉永明等對(duì)槲皮素在玻碳電極上伏安行為進(jìn)行了研究，證明槲皮素在玻碳電極上的反應(yīng)是準(zhǔn)可逆反應(yīng)。槲皮素和綠原酸同時(shí)測(cè)定的分析方法還未見報(bào)道。
毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法（CE-ED）對(duì)具有電化學(xué)活性的天然藥物成分分析具有明顯的*性，靈敏度高、分離效率高、樣品不需要預(yù)處理，設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，不但使常規(guī)的中藥成分的檢測(cè)更加便捷，而且為藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究所需要的血樣中痕量代謝產(chǎn)物的測(cè)定提供了可能，因此CE-ED聯(lián)用的分析方法越來越受到中藥研究者的重視。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1．1 儀器和試劑
自組裝的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)：高壓電源（士3OkV（中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所），未涂層熔融石英毛細(xì)管（φ25μmx 70cm，河北永年光纖廠），三電極工作系統(tǒng)（O.5mm碳圓盤電極，鉑對(duì)電極， Ag /AgC1參比電極），BAS LC-4C型電化學(xué)檢測(cè)器（Bioanalytical System，West LafayeRe，In，USA）用于控制恒電位下電化學(xué)反應(yīng)，TL9900色譜工作站（北京泰立化電子技術(shù)有限公司）用于處理色譜儀信號(hào)數(shù)據(jù)，pHS-2C型精密酸度計(jì)（上海第二分析儀器廠），超聲波清洗器（Branson，USA）。標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸和槲皮素均由北京藥品生物制品檢定所提供；中藥石韋采購(gòu)于福州藥店和江西藥店；其它實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑均為AR級(jí)，水為二次蒸餾水。
1．2 實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
準(zhǔn)確稱量1.0mg綠原酸和1.0mg槲皮素，分別用2.0mL乙醇溶解，然后用15mmol／L的磷酸鹽（pH=7.0）的緩沖溶液定容至10mL，配制成0.10mg／mL的儲(chǔ)備液。
1．2．2 樣品溶液制備
將一定量的石韋藥材洗凈、烘干后磨碎．準(zhǔn)確稱取100mg石韋，用二次水煎煮2h或乙醇提取3h，放置12h，然后，將提取好的石韋過濾，用運(yùn)行液定容于100mL的容量瓶，備用。分別提取了江西、福州兩個(gè)產(chǎn)地的石韋。
取健康人血樣10mL用高速離心機(jī)離心后，取血清部分，即為血液空白樣。在血清中準(zhǔn)確加人一定量綠原酸和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩、超聲5min，精密吸取0.10mL上層清液，用緩沖液稀釋至1.0mL，模擬樣品中的CGA和QA的濃度均為1.0μg／mL。
所有溶液在使用前均用聚乙烯濾膜（0.22μm）過濾，并經(jīng)超聲波除去細(xì)小氣泡．
1．2．3 毛細(xì)管處理
未使用過的毛細(xì)管先用0.50mol／L的NaOH溶液活化3h，再用二次水沖洗15min，zui后依次用0.050 mol／L NaOH、二次水溶液沖洗．每運(yùn)行5次以后，毛細(xì)管先以0.050 mol／L NaOH 溶液洗3min，再用二次水洗3min，而后換成電泳液施加高壓使其平衡穩(wěn)定3min。 21kV下電動(dòng)進(jìn)樣10s，然后進(jìn)行分離分析測(cè)定．所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。
2 結(jié)果與討論
2．1 靜態(tài)與動(dòng)態(tài)伏安圖
電化學(xué)檢測(cè)作為毛細(xì)管電泳zui靈敏檢測(cè)方法之一，選擇被分析物質(zhì)的*工作電位是非常重要的。為此考察了綠原酸（CGA）和槲皮素（QC）的電化學(xué)行為，首先將兩個(gè)被測(cè)物進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，得到靜態(tài)伏安圖。從圖中可以看出綠原酸和槲皮素均有氧化峰，說明兩物質(zhì)均有電化學(xué)活性。
進(jìn)一步考察了在pH 7.0，10.0mmol／L磷酸鹽（PB）緩沖溶液中綠原酸和槲皮素于碳圓盤電極上的動(dòng)態(tài)伏安圖。從圖中可以看出，綠原酸和槲皮素的氧化峰電流都隨著電極電位的增大而增大。當(dāng)電極電位低于800mV時(shí)，綠原酸和槲皮素產(chǎn)生的峰電流很小，這意味著綠原酸和槲皮素此時(shí)在電極上幾乎不發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。電位范圍在800～1000mV時(shí)，綠原酸的峰電流急劇增大，而槲皮素的峰電流卻增加緩慢。當(dāng)電位大于1000mV時(shí)，綠原酸和槲皮素的響應(yīng)電流繼續(xù)增加，然而此時(shí)基流也開始急劇增大，這種情況使實(shí)驗(yàn)中使用的測(cè)量和記錄系統(tǒng)難以達(dá)到要求，而且很不穩(wěn)定．因此選1000 mV為*的工作電位，在此電位下，不僅信噪比zui大，而且工作電極可以在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性．
2．2 緩沖液的pH值和濃度的影響
由于離子電荷和粒徑取決于溶質(zhì)在溶液中的溶解、離解、締和等因素，因此溶質(zhì)的成分和濃度決定了其在毛細(xì)管中的遷移行為；同時(shí)，電泳液酸度對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁的電荷則起決定作用，因此運(yùn)行液的性質(zhì)、酸度和濃度共同決定了分離的電滲流，從而決定了分離效率．分別試驗(yàn)了檸檬酸鹽、硼砂、磷酸鹽、醋酸鹽四種緩沖液對(duì)被分析物分離效果的影響，結(jié)果表明綠原酸和槲皮素在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中的分離效果．
進(jìn)一步考察了酸度對(duì)分離的影響，在4.O～9.0范圍內(nèi)PBS的pH值與遷移時(shí)間的關(guān)系如圖所示表明，槲皮素的遷移時(shí)間隨著pH的增大而增大，而酸度對(duì)綠原酸的遷移時(shí)間幾乎沒有影響，因而兩者的分離度隨pH增大而增大。pH在7.0附近時(shí)兩組分已經(jīng)可以*分離，為了節(jié)約分析時(shí)間，所以選擇*酸度為pH 7.0。
研究了5.O～25.0mmol／L的緩沖液濃度對(duì)分離度及遷移時(shí)間的影響，結(jié)果標(biāo)明：隨著PBS濃度的降低，兩待測(cè)物質(zhì)的遷移時(shí)間都隨濃度的降低有不同程度的降低。當(dāng)濃度大于或者等于10.0 mmol／L時(shí)，綠原酸和槲皮素能得到很好的分離．為了保證較好的分離效果，又節(jié)省分離時(shí)間，選擇10.0mmol／L的PBS（pH 7.0），為*運(yùn)行液。
2．3 分離電壓和進(jìn)樣量的影響
分離電壓對(duì)分離時(shí)間和分離效果通常也有較大影響。當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度固定時(shí)，遷移時(shí)間與外加電壓成反比。實(shí)驗(yàn)了分離電壓為15、18、21、24、27kV時(shí)兩待測(cè)物質(zhì)的遷移時(shí)間，結(jié)果表明隨著分離電壓的增大，兩待測(cè)物質(zhì)的遷移時(shí)間逐漸減小。高壓有利于提高分離速度，可是，過大的電壓則使毛細(xì)管內(nèi)電流顯著增大，從而引起焦耳熱。為了保證分離效率，實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇21 kV為分離電壓。由于本實(shí)驗(yàn)采用電動(dòng)進(jìn)樣，因而進(jìn)樣時(shí)間會(huì)直接影響到檢測(cè)靈敏度。在21 kV電壓下，分別設(shè)置進(jìn)樣時(shí)間為2、5、10、15s時(shí)測(cè)量峰高。結(jié)果表明，響應(yīng)峰電流隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于10s時(shí)，峰形有明顯的展寬，因此選擇進(jìn)樣時(shí)間為10s（21kV）。
為在*條件下綠原酸和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)混合液的電泳圖可見，兩個(gè)被測(cè)物在8min內(nèi)可以達(dá)到基線分離。
2．4 方法的特性
用CE-ED方法，在上述選定條件下，對(duì)一系列不同濃度的綠原酸和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)混合樣品進(jìn)行分析測(cè)定，以電泳譜圖中的峰高Y（nA）分別對(duì)綠原酸和槲皮素濃度X（μg／mL）進(jìn)行回歸分析，所得到的綠原酸和槲皮素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限如表所示（每一份樣品平均測(cè)定5次）。綠原酸和槲皮素的線性范圍分別為：0.10～10.0μg／mL和0.050～1O.0μg／mL，其直線方程的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999。以三倍信噪比確定綠原酸和槲皮素的檢測(cè)
限分別為：0.075、0.020μg／mL．表明本方法線性良好，靈敏度高。
2．5 天然植物石韋樣品測(cè)定及其回收率的測(cè)定
在上述優(yōu)化的條件下，按照1．2．2所敘述的方法分別用水或乙醇提取福州、江西兩地石韋樣品，不需預(yù)處理，直接電動(dòng)進(jìn)樣，實(shí)際石韋樣品的電泳譜圖，對(duì)照?qǐng)D標(biāo)準(zhǔn)電泳譜圖可知，用水煮法提取的福州石韋樣品電泳譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖*相符，而用乙醇提取的江西石韋樣品譜圖中的槲皮素的出峰時(shí)間延長(zhǎng)將近1min，這可能是由于樣品帶中的乙醇對(duì)被測(cè)組分遷移時(shí)間造成一定的影響。雖然天然藥物含有復(fù)雜的成分，但因?yàn)槠渲猩儆腥菀妆浑娀瘜W(xué)氧化的物質(zhì)，因此電泳圖譜中除了綠原酸和槲皮素兩組分以外，未出現(xiàn)了明顯的非測(cè)定物質(zhì)的譜峰，說明背景物質(zhì)對(duì)石韋樣品的測(cè)定并沒有造成干擾。記錄所得的峰電流，根據(jù)表1中的回歸方程計(jì)算，得到的天然藥物石韋的分析結(jié)果總結(jié)于下表。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法用于定量分析石韋時(shí)的綠原酸和槲皮素的可行性，進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。在1.0mL石韋藥材的樣品加入1.0、2.0和5.0μg綠原酸；2.O、4.0和10.0μg槲皮素，測(cè)定峰電流，根據(jù)回歸方程計(jì)算得綠原酸和槲皮素含量，扣除原來樣品中綠原酸和槲皮素的量以后，進(jìn)行回收率計(jì)算，結(jié)果列于表可見，石韋藥材中的綠原酸和槲皮素回收率在94.5%～105%之間，*實(shí)際樣品對(duì)分析方法的要求，證明該方法用于石韋的測(cè)定是準(zhǔn)確的、可靠的。
2．6 模擬生物體液樣品的測(cè)定
在上述優(yōu)化的條件下，按照1．2．2所敘述的方法提取模擬血樣以后，不需預(yù)處理，直接電動(dòng)進(jìn)樣分離，人體血樣的電泳譜圖。通過加標(biāo)試驗(yàn)，證明電泳譜圖中的峰a和峰b分別是綠原酸和槲皮素。血樣中不明物質(zhì)峰對(duì)綠原酸和槲皮素的測(cè)定不形成干擾。
3 結(jié)論
建立了毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)同時(shí)測(cè)定石韋中的綠原酸和槲皮素的方法。該法靈敏度高、選擇性好，簡(jiǎn)單、快速，用于模擬血樣中綠原酸和槲皮素的分析，結(jié)果同樣令人滿意。因此，該方法不但可作為控制與保障天然藥物石韋質(zhì)量的手段，在藥物代謝機(jī)理的研究方面也有一定的應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn)：
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編．中華人民共和國(guó)藥典（2000年版一部）[M]．北京：化工出版社，2000．
[2] 彭密軍．杜仲葉中綠遠(yuǎn)酸的提取分離及含量測(cè)定[J]．林業(yè)科技，1999，24（6）：41—42．