早期AAV(Adeno-associated virus,簡稱AAV — 腺相關病毒)產品的病毒載體培養(yǎng)方式多采用貼壁培養(yǎng)。但隨著工藝的提升，懸浮培養(yǎng)能更好地滿足生產工藝的放大升級，故此，由貼壁培養(yǎng)轉向懸浮培養(yǎng)的293T細胞系成為了新型趨勢。
本文分享一則新型HEK293細胞AAV包裝工藝研究實例，主要基于樂純生物LePhinix®EZG 臺式生物反應器中Pro款型號，即：LePhinix®EZG Pro 臺式生物反應器，通過自研的TinnBio自控軟件實現(xiàn)對搭載玻璃罐的精準控制，實現(xiàn)AAV高表達滴度、高體積培養(yǎng)。
設備與工藝
培養(yǎng)參數(shù)
本研究采用樂純生物集團旗下康晟生物自主研發(fā)的Wayne293®瞬轉培養(yǎng)基，培養(yǎng)懸浮細胞Wayne® LVPro HEK293。
LePhinix®EZG Pro 臺式生物反應器參數(shù)設置如下表1所示，接種前，需對玻璃罐進行保壓測試及滅菌梳理，再加入Wayne293®瞬轉培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)參數(shù)參考表2。
表1.LePhinix®EZG Pro 臺式生物反應器配置參數(shù)
表2.玻璃罐參數(shù)設置
培養(yǎng)小Tips
懸浮培養(yǎng)過程中，AAV轉染需注意：
接種密度、轉染細胞密度、轉染時間；轉染培養(yǎng)基；質粒比例、質?？偭?、PEI與質粒比例；轉染后收貨時間等因素，這些變量因素是決定AAV產量高低的關鍵。
培養(yǎng)工藝
搖瓶階段：
?、俜N子復蘇后，每隔 48h 按照 0.5M 傳代；
②種子輕微聚團，可適當提高搖床轉速或者采用帶檔板搖瓶培養(yǎng)；
?、垡话憬ㄗh細胞濃度達到2.5M~3.0M，且活率>95%進行轉染；
轉染階段：
?、俎D染前檢測細胞懸液中 Glc&Gln 含量，需調整懸液 Glc≥6g/L 和 Gln≥4mM；
?、谵D染試劑配置時，推薦質粒：PEI=1：3，且現(xiàn)配現(xiàn)用；
上罐階段：
?、傧冉尤虢K體積 80% 培養(yǎng)基，設置參數(shù)，空罐預培養(yǎng) 4h 以上；
?、诎凑?0.5M 接種進行操作；
?、勖刻鞜o菌取樣計數(shù)，待細胞濃度達到2.5M~3.0M，且活率>95%進行轉染；
?、苻D染后每隔 24h 取樣計數(shù)，流式或熒光拍照得出轉染效率，留樣 QPCR 等；
?、菀话戕D染 72h 左右實驗室測得GFP(目的基因)轉染效率最高，最后進行 QPCR 病毒滴度測試；
?、逌蕚湎鹿藁蚶^續(xù)培養(yǎng)，收集數(shù)據(jù)。
注：優(yōu)化工藝階段，可通過不同時間段留樣對比目的基因的轉染效率與滴度值波動的相關性，選取最優(yōu)工藝，進行后續(xù)生產。
數(shù)據(jù)分析
表3.1L(200rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
注：day05 72h 測 QPCR 為 8.41E+11copies/ml。
圖1.轉染24h熒光照片
圖2.轉染48h熒光照片
圖3.轉染72h熒光照片
表4.1L(220rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
圖4.轉染24h熒光照片
圖5.轉染48h熒光照片
圖6.轉染72h熒光照片
表5.5L(80rpm)某批次培養(yǎng)數(shù)據(jù)
注：day05 72h 測 QPCR 為 1.18E+12copies/ml。
圖8 轉染24h熒光照片
圖9 轉染48h熒光照片
圖10 轉染72h熒光照片
結論
通過以上幾批玻璃罐內包裝 AVV 實驗數(shù)據(jù)可知，轉染第三天 AVV 滴度穩(wěn)定表達 8~9E+11copies/ml，其中 5L 培養(yǎng)體積最高達到 1.18E+12copies/ml。
對比臺式反應器控制 200rpm 和 220rpm 批間差異不大，細胞生長過程一致，數(shù)據(jù)具有高度重合性，說明臺式反應器控制精準，各部件協(xié)作調控功能穩(wěn)定。
綜上，LePhinix®EZG PRO臺式反應器可實現(xiàn)溫度，pH，溶氧等關鍵工藝參數(shù)的精準控制，搭配Wayne293® 瞬轉培養(yǎng)基，可更好的實現(xiàn)293細胞AAV包裝工藝優(yōu)化，提升293細胞的生長效果和達到更高的病毒產量。
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LePhinix®EZG 臺式生物反應器
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關于Wayne293® 瞬轉培養(yǎng)基
Wayne293® 瞬轉培養(yǎng)基是一款針對人類胚胎腎細胞 293 (HEK293) 和其衍生細胞系所研發(fā)的無血清、無動物成分培養(yǎng)基，適用于 HEK293 系列細胞懸浮培養(yǎng)、化學轉染及瞬時轉染，具有高密度增殖、高效率轉染和高產量表達的獨特優(yōu)勢。
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