近年來，對藥物片劑化學(xué)成像技術(shù)受到日益廣泛的關(guān)注。隨著技術(shù)改進(jìn)與應(yīng)用普及，化學(xué)成像已成為獲取關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)信息的有效手段，這些參數(shù)通過其他技術(shù)往往難以準(zhǔn)確測定。除大型制藥企業(yè)外，仿制藥廠商乃至監(jiān)管機(jī)構(gòu)1現(xiàn)已普遍認(rèn)可該技術(shù)在生產(chǎn)故障排查、生產(chǎn)規(guī)模提升及根本原因分析中的價值2。
在眾多成像技術(shù)中，近紅外（NIR）成像技術(shù)憑借其顯著優(yōu)勢獲得最多關(guān)注，并作為過程分析技術(shù)(PAT)手段展現(xiàn)出持續(xù)發(fā)展?jié)摿?。拉曼成像和中紅外漫反射等其他化學(xué)成像技術(shù)雖各具優(yōu)劣，但NIR在技術(shù)實施、操作便捷性及樣品適應(yīng)性方面更具優(yōu)勢。
該技術(shù)生成的數(shù)據(jù)也更容易被該領(lǐng)域內(nèi)的眾多用戶所理解，因為他們可能擁有片劑成分的宏觀近紅外光譜分析經(jīng)驗。然而，現(xiàn)有技術(shù)(無論是傅里葉變換、可調(diào)濾波器或固定濾波器)條件下的NIR成像存在本質(zhì)局限，其根源在于測量原理本身而非技術(shù)缺陷。
首先
入射光在樣品中的穿透深度較大(數(shù)十微米級)，漫反射特性會導(dǎo)致圖像實質(zhì)性地模糊。根據(jù)估算，樣品穿透深度至少達(dá)到10微米(具體取決于粒徑、填料等參數(shù))，但許多片劑成分在被投入攪拌機(jī)進(jìn)行混合時的粒徑實則小于10微米。因此除非這些成分形成聚集體，否則該技術(shù)難以獲得清晰展現(xiàn)成分特征在空間分布的圖像。
值得注意的是，關(guān)于NIR成像的現(xiàn)有文獻(xiàn)中尚未涉及10微米以下的單顆粒粒徑分布。研究案例多聚焦于小顆粒聚集體或數(shù)十至數(shù)百微米的較大顆粒，而粒徑小于10微米的顆粒理應(yīng)存在于分布中。對于某些成分(如硬脂酸鎂)，即使?jié)舛容^高，若未形成約30-40微米或更大的聚集體，則會因為這種物質(zhì)以相對細(xì)小的顆粒分布在整個基質(zhì)中，也難以被NIR成像檢測到。事實上，某些含量低于1%的活性成分除非形成聚集體，否則根本無法被檢出。
其次
成像中測得的NIR光譜往往存在高度重疊。在宏觀近紅外光譜分析中，NIR光譜的區(qū)分度通常不及對應(yīng)的拉曼成像或中紅外光譜，而這一劣勢在信噪比低于宏觀近紅外光譜分析的NIR成像中更為突出。這兩大因素導(dǎo)致成像分析高度依賴于對光譜數(shù)據(jù)的化學(xué)計量學(xué)分析。此外，后續(xù)圖像分析還需運用像素統(tǒng)計技術(shù)，這通常要求將單個圖像像素按化學(xué)類別歸類，但在實際操作中極具挑戰(zhàn)性，因為NIR圖像中單個像素所呈現(xiàn)的組分光譜極少是純凈的。這使得NIR圖像的整體分析更為困難，因為對灰度像素進(jìn)行“1”或“0”賦值時往往帶有一定程度的主觀性。
相較于其他技術(shù)，中紅外光譜分析中的ATR(衰減全反射)光譜成像技術(shù)在該應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：其空間分辨率較NIR成像提升約一個數(shù)量級，目前已達(dá)到許多成分進(jìn)入加工時的單個粒徑量級，即小于10微米。已證實ATR成像技術(shù)具有優(yōu)于5微米的空間分辨率4；其次，與NIR相比，圖像中的光譜具有更高對比度，更易區(qū)分不同成分；第三，該技術(shù)實際上是一種表面分析技術(shù)，采用下文所述的光學(xué)配置時，樣品穿透深度僅為約1-2微米。這使得單個像素的光譜相對更為純凈，從而大幅減輕了后續(xù)圖像分析的工作量，較NIR技術(shù)具有明顯優(yōu)勢。高光譜NIR成像分析中的某些技術(shù)完全可應(yīng)用于ATR成像分析。
ATR技術(shù)還具有以下優(yōu)勢：
• 可直接調(diào)用大型商用光譜庫進(jìn)行定性鑒別；
• 對于NIR技術(shù)難以識別的物質(zhì)(如某些無水無機(jī)鹽)，ATR技術(shù)能產(chǎn)生高對比度光譜。
我們已為珀金埃爾默Spotlight™ 400顯微成像系統(tǒng)開發(fā)了ATR附件，并完成多種藥物片劑測試。本應(yīng)用文獻(xiàn)市售藥物片劑的ATR成像測量，并驗證了前文所述的諸多技術(shù)優(yōu)勢。該技術(shù)標(biāo)志著藥物片劑成像技術(shù)取得重大突破。雖然目前尚處于“萌芽”階段，但預(yù)計將在未來藥物片劑及混合物的分析中發(fā)揮重要作用。
實驗設(shè)計
01 樣品制備與情況介紹
本文采用未包衣的完整藥物片劑(含處方藥與非處方藥(OTC))，并獲取了已知存在于片劑中的原料的樣品。處方藥的成分包括：活性成分、微晶纖維素、磷酸氫鈣、淀粉和硬脂酸鎂；OTC產(chǎn)品的原料是阿司匹林、對乙酰氨基酚、咖啡因，以及多種有機(jī)和無機(jī)輔料。在本例中，片劑厚度為2-3 mm，側(cè)面垂直、表面平整。
ATR附件采用鍺晶體(圖1)，將其貼合片劑表面。該附件的設(shè)計特點在于：可通過可見光顯微攝像頭定位樣品目標(biāo)區(qū)域(ROI)，無需移動樣品即可使ATR采樣表面精準(zhǔn)覆蓋ROI。晶體貼合端可形成圓形采樣區(qū)域，在此范圍內(nèi)可定義不同尺寸的方形或矩形成像區(qū)域。以1.56微米的圖像像素尺寸計算，在500×500微米區(qū)域內(nèi)將包含超過102,000條獨立光譜數(shù)據(jù)。
圖1.ATR采樣配置
為進(jìn)行最全面的圖像分析，可能需要獲取片劑原料的ATR光譜作為參考。最佳方案是直接使用ATR成像系統(tǒng)測量光譜，而非從標(biāo)準(zhǔn)參考庫中提取，盡管也可以使用后一種方案，但會導(dǎo)致圖像分析質(zhì)量有所下降。本文采用紅外光譜分析中常用的標(biāo)準(zhǔn)溴化鉀(KBr)微型壓片附件，為片劑的每種原料制備了簡易微片。使用標(biāo)準(zhǔn)微型壓片(2 mm模具)附件時，手持壓力即可制備出適用于ATR數(shù)據(jù)采集的微片。壓制成型后，將壓片轉(zhuǎn)移至ATR附件，對純凈組分進(jìn)行50×50微米的小區(qū)域成像測量。基于這些圖像，使用軟件計算出單獨的參考光譜。每種成分的參考圖像采集僅需數(shù)分鐘，且此類操作通常只需進(jìn)行一次。
02 成像
采用配備ATR成像附件的標(biāo)準(zhǔn)Spotlight™ 400顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。該系統(tǒng)通過MCT陣列探測器與移動采樣臺/ATR附件的協(xié)同工作生成圖像。ATR晶體固定于樣品表面并與樣品保持相對靜止-樣品與ATR晶體作為一個整體則相對于檢測器移動。圖像像素尺寸為1.56×1.56微米 (可選6.25×6.25微米)，光譜分辨率為16 cm-1。本文采集的實際圖像尺寸范圍為100×100微米至400×400微米，總采集時間介于1分鐘至約40分鐘之間。
圖像數(shù)據(jù)處理包含光譜微分化、歸一化、主成分分析等步驟，并進(jìn)行最小二乘全光譜曲線擬合。另5進(jìn)行了進(jìn)一步的圖形圖像增強(qiáng)與統(tǒng)計分析。
結(jié)果和討論
作為接觸式技術(shù)，樣品一旦接觸晶體表面即被污染，因此每次成像前都需要清潔晶體。然而，除非片劑顆粒具有強(qiáng)粘附性，否則清潔過程相對迅速。
作為接觸式技術(shù)，樣品一旦接觸晶體表面即被污染，因此每次成像前都需要清潔晶體。然而，除非片劑顆粒具有強(qiáng)粘附性，否則清潔過程相對迅速。
圖2a展示了片劑表面的可見光顯微圖像。雖可辨識部分顆粒結(jié)構(gòu)，但僅憑可見光圖像無法有效區(qū)分各組分顆粒。
圖2b則清晰呈現(xiàn)了淀粉組分的分布情況。該圖像是通過對ATR成像數(shù)據(jù)進(jìn)行本節(jié)所述的多重處理步驟后獲得的。
采用類似方法可推導(dǎo)每個成分的分布模式，進(jìn)而構(gòu)建合成圖像。本文將三種主要組分的圖像合并為一個單獨的RGB(紅/綠/藍(lán))三通道合成圖像(圖2c)，此類表征方式在此類產(chǎn)品的NIR成像中較為常用。而本測試的不同之處在于：相較于NIR成像，其空間分辨率顯著提升，圖像的空間對比度更高，從而能在相對較短的測量時間內(nèi)獲得更清晰、更詳盡的片劑表面圖像，并能定位當(dāng)前NIR成像技術(shù)無法檢測到的微觀區(qū)域。
圖2.3個主要組分的片劑表面可見光圖像(a)、微分處理后的單組分紅外成像圖(b)及合成圖像(c)(點擊查看大圖)
01 原料光譜
圖3展示了一種片劑原料的ATR光譜及其對應(yīng)的一階微分處理光譜。通過ATR成像可觀察到，晶體元件整個表面的照明場并非完全平坦，這主要表現(xiàn)為整個晶體區(qū)域測得的光譜存在平滑基線偏移現(xiàn)象。通過使用一階或二階微分可以輕松解決這一問題。需要指出的是，與近紅外成像相比，該方法的原料光譜特征更為顯著，這為圖像分析中采用更簡單的單變量方法提供了更大可能性。在測試過程中，添加了藥片中本不存在的常見原料聚乙烯吡咯烷酮作為測試樣本，以驗證后續(xù)數(shù)據(jù)處理的有效性。
圖3.原料成分(點擊查看大圖)
02 檢測片劑成分的存在情況
第一步是確認(rèn)圖像光譜中是否存在原料的光譜特征。這一步通過軟件的“Target”功能實現(xiàn)。先對圖像光譜進(jìn)行預(yù)處理(一階微分處理，并刪去二氧化碳吸收區(qū))，再通過主成分分析(PCA)提取主要獨立光譜貢獻(xiàn)。隨后將原料或“目標(biāo)”光譜與PCA主成分的線性組合進(jìn)行擬合，擬合的緊密程度可判斷圖像光譜中是否存在目標(biāo)光譜。圖4顯示了片劑五種組分的檢測結(jié)果。五種成分的擬合質(zhì)量均十分出色，而聚維酮的擬合質(zhì)量較差，有力驗證了該方法的可靠性。
圖4.檢測原料的存在情況
03 評估片劑內(nèi)每種成分的分布
在確認(rèn)圖像光譜中存在目標(biāo)光譜后，下一步是通過估算圖像中每個像素點的成分相對豐度，來生成各組分的分布圖。雖然有多種方法，但針對這種五組分體系(假設(shè)組分間無化學(xué)反應(yīng)且可獲得純凈的原料光譜)，研究發(fā)現(xiàn)簡單的全光譜曲線擬合方法效果良好。在通過上述主成分分析檢查殘留圖像、檢查是否存在其他化學(xué)組分后，只需要將每個像素的光譜建模為原料光譜的線性組合即可。需要注意的是，若目標(biāo)光譜間存在強(qiáng)交叉相關(guān)性(即多個目標(biāo)光譜具有多個共同特征峰)，該技術(shù)的可靠性會降低。本例中，微晶纖維素與淀粉光譜雖明顯存在一定相關(guān)性，但其差異度仍足以保證良好的最小二乘曲線擬合條件。圖5展示了五種成分的光譜曲線擬合結(jié)果，各圖像中的像素強(qiáng)度直觀反映了圖像光譜中目標(biāo)光譜的相對豐度。
圖5a.微晶纖維素的最小二乘擬合圖像
圖5b.淀粉的分布圖
圖5c.磷酸鈣的分布圖
圖5d.硬脂酸鎂的分布圖
圖5e.活性成分(< 1%)的分布圖
在大多數(shù)情況下，衍生圖像中的“熱點”區(qū)域顯示出與純凈組分光譜相似的特征，而顆粒邊緣的像素則呈現(xiàn)預(yù)期的“混合”光譜特征。圖中展示了典型熱點光譜及對應(yīng)的原料光譜。
這些圖像呈現(xiàn)三個顯著特征：
1 光譜對比度及圖像清晰度極為顯著，遠(yuǎn)超大多數(shù)NIR成像技術(shù)產(chǎn)生的圖像。通過繪制圖像直方圖分布可輕松驗證這一點。
2 不同成分的熱點區(qū)域(顆粒)不僅存在形狀差異，而且還開始呈現(xiàn)出與原料顆粒相似的形狀。例如，圖6a展示了淀粉顆粒掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，可見淀粉顆粒呈高度球形，這與許多其他成分不同。而對應(yīng)的ATR衍生圖像(圖6b)中顆粒呈現(xiàn)相似形狀。同樣，硬脂酸鎂和微晶纖維素區(qū)域的不規(guī)則形狀也與原料SEM圖像高度吻合。這一發(fā)現(xiàn)得益于成像保真度相較于NIR有改善，為理解空間分布與產(chǎn)品質(zhì)量屬性的關(guān)聯(lián)提供了額外的重要依據(jù)。
圖6.ATR顆粒圖像形狀-與SEM相比較
3 該技術(shù)可分辨10微米以下的單個顆粒。圖7展示了活性成分計算分布圖的放大區(qū)域，該成分在片劑中的已知濃度低于1%(按重量計算)，其中可見直徑6-7微米的熱點。熱點處的光譜表明，許多像素點幾乎完全呈現(xiàn)活性成分的純凈光譜。值得注意的是，獨立分辨率研究6估計該技術(shù)在約1700cm-1波數(shù)附近的空間分辨率可達(dá)3-4微米量級，單顆粒光譜的清晰度同樣十分突出。
圖7a.活性成分(< 1%)的分布圖
圖7b.< 10微米的活性成分顆粒
第二個示例見圖8，其中展示了小粒徑的分辨率。該示例對某種OTC可溶性止痛片進(jìn)行了成像分析。NIR成像技術(shù)常以此類產(chǎn)品作為演示樣本來展示其分析能力。其主要成分-阿司匹林、對乙酰氨基酚和咖啡因-以數(shù)十至數(shù)百微米的粒徑呈大區(qū)域形態(tài)分布。但本示例不僅呈現(xiàn)了上述主要成分的圖像，還成功呈現(xiàn)了具有以下特征的輔料：(a)含量低；(b)更重要的是其分布區(qū)域尺寸小于10微米。雖然許多賦形劑和原料藥(API)的初始粒徑均小于10微米，但NIR成像技術(shù)難以檢測到該尺度的單個顆粒，只能檢測到這些顆粒形成的更大尺寸的聚集物。圖中不僅顯示了主要成分，還顯示了阿司匹林/咖啡因/對乙酰氨基酚分布中所包含的NIR檢測不出的單個磷酸鈣顆粒。
圖8a.止痛片–總體結(jié)構(gòu)-阿司匹林
圖8b.對乙酰氨基酚分布重疊
圖8c.微晶纖維素分布重疊
圖8d.揭示微量成分-碳酸鈣
圖8e.碳酸鈣圖像的分解視圖
圖8f.阿司匹林區(qū)域內(nèi)的碳酸鈣
04 片劑成分分布的表征
如圖9所示的高質(zhì)量單一成分分布圖，人眼可觀察到片劑中不同成分間的明顯差異。但若需進(jìn)行更快速、更客觀的表征，則需要采用不同的圖像表達(dá)方式。一種方法是圖像的強(qiáng)度直方圖表示法。常規(guī)方法是，對于指定的圖像，基于像素數(shù)量繪制對應(yīng)的像素亮度，通過分析生成的直方圖可獲取與片劑關(guān)鍵工藝參數(shù)相關(guān)的有用信息。對于高清晰度ATR圖像，當(dāng)以這種方式繪制成分分布圖時，生成的直方圖通常呈現(xiàn)兩種不同的模式，分別對應(yīng)目標(biāo)顆粒群和剩余顆粒(如圖9a所示)。然而，這兩個直方圖區(qū)域之間的分界線并非總是清晰可辨。由于這是灰度圖像，會存在大量介于“純”顆粒像素和“純”背景像素之間的像素。在進(jìn)行像素計數(shù)時，這些像素需要被歸類為前景像素或背景像素，即必須設(shè)定一個強(qiáng)度閾值：高于該閾值的像素屬于目標(biāo)顆粒，低于該閾值的像素則屬于背景像素。
圖9a.單個成分分布直方圖(點擊查看大圖)
閾值可通過數(shù)學(xué)算法(如“最大熵法”?)或根據(jù)主觀經(jīng)驗判定。對于ATR圖像分析，已發(fā)現(xiàn)結(jié)合以下信息來確定強(qiáng)度閾值十分有用：原料粒徑、迭代閾值調(diào)整，以及底層像素光譜的檢查結(jié)果。
圖9b顯示了閾值設(shè)置過程：圖中顯示了一個組分分布的計算灰度圖像，其強(qiáng)度閾值設(shè)定在兩個水平，以保留強(qiáng)度最高的圖像像素。哪個圖像是正確的？雖然對該問題的詳細(xì)討論已超出本文范圍，但該閾值的設(shè)定是從這些圖像中獲取準(zhǔn)確定量信息的關(guān)鍵，必須極其謹(jǐn)慎地處理。然而，當(dāng)計算出清晰可辨的顆粒分布時，所得到的某些統(tǒng)計結(jié)果(如平均粒徑、分布形狀、最近鄰信息等)與產(chǎn)品質(zhì)量屬性存在關(guān)聯(lián)。
圖9b.設(shè)置A-B閾值，以產(chǎn)生二值圖像(點擊查看大圖)
圖9c顯示了標(biāo)記為“合格”與“不合格”的兩批產(chǎn)品中某一指定成分的計算成分分布對比。分別采集了合格批次和不合格批次中不同樣品的五個圖像。除一種成分外，合格與不合格批次中其他所有成分的平均粒徑計算結(jié)果均一致。而對于該特殊成分，所有圖像均顯示不合格批次的平均粒徑約為合格批次的2倍。這類信息對于識別生產(chǎn)工藝問題具有極高價值。
圖9c.部分指標(biāo)可與質(zhì)量參數(shù)相關(guān)聯(lián)(點擊查看大圖)
結(jié)論
ATR化學(xué)成像技術(shù)提升了某些類型藥物片劑化學(xué)成像的技術(shù)水平。與NIR化學(xué)成像相比，該技術(shù)能顯著提高可實現(xiàn)的圖像空間分辨率，獲得更清晰且通常更易解讀的圖像。該技術(shù)克服了中紅外光譜分析中直接漫反射成像的主要局限，即圖像中高信號衰減和不受控的鏡面反射干擾的問題。同時解決了拉曼成像的多個缺陷，包括樣品過熱、潛在熒光干擾、空間分辨率有限(取決于拉曼成像硬件配置)以及圖像采集時間相對較長。
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