北京時(shí)間10月2日，備受矚目的“2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)”被授予科學(xué)家Drew Weissman和Katalin Karikó，以表彰他們在mRNA疫苗領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)。
 

　　在新冠爆發(fā)之前，mRNA疫苗對(duì)大多數(shù)人來說還是一個(gè)相對(duì)陌生的概念。這種疫苗是通過編碼病原體某個(gè)蛋白組分的基因序列的mRNA，在體內(nèi)表達(dá)成蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原呈遞，并具有自佐劑作用。相比其他疫苗，mRNA疫苗具有“即插即用”的優(yōu)勢，只需知道病原體結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列就可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。此外，它還能在體內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生高滴度的抗體，因此被選為疫苗之選。接下來，讓我們一起看看兩位諾獎(jiǎng)得主在2018年發(fā)表的一篇文章^[1]，以更好的理解mRNA疫苗到底有多牛！
 

 

　　這篇文章對(duì)mRNA疫苗的研究非常全面:
 

　　1、涉及了流感疫苗、HIV疫苗和寨卡疫苗
 

　　2、包含小鼠和靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
 

　　3、從體液應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面對(duì)疫苗進(jìn)行評(píng)估
 

　　m1Ψ-mRNA-LNP 可長時(shí)間有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)
 

　　1-甲基假尿苷(m1Ψ)修飾mRNA，可以防止mRNA疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能提高蛋白質(zhì)的表達(dá)效率。這是兩位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者對(duì)mRNA疫苗做出的重要改進(jìn)之一。接下來，我們來看一下這種改進(jìn)帶來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
 

　　圖1. 相對(duì)與未修飾的mRNA-LNP，編碼熒光素酶(Luc)的m1Ψ-mRNA-LNP的翻譯水平較高，并可以維持13天的蛋白質(zhì)表達(dá)
 

　　小鼠細(xì)胞免疫評(píng)估
 

　　圖2. 相比于對(duì)照mRNA、滅活流感病毒疫苗以及未修飾mRNA疫苗，m1Ψ修飾的HA mRNA疫苗(編碼流感病毒HA蛋白)能產(chǎn)生更強(qiáng)的抗原特異性CD4+細(xì)胞免疫應(yīng)答
 

　　對(duì)于CD8+細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果也類似。HA mRNA疫苗免疫后，總脾GC(生發(fā)中心)B細(xì)胞大幅增加(約8-59倍)，單次免疫后8天脾漿細(xì)胞的數(shù)量也增加，并顯著增加了脾臟中Tfh細(xì)胞(濾泡輔助性T細(xì)胞)總數(shù)
 

　　小鼠抗體評(píng)估
 

　　流感疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度主要通過血凝抑制(HAI)測定法來測量。在這種方法種，1:40的體外HAI滴度被認(rèn)為可以保護(hù)人類免受流感感染。在接種HA mRNA疫苗單次免疫后，在2周觀察到640的HAI滴度，在4周時(shí)這個(gè)數(shù)值增加到2000。
 

　　圖3. 在體液免疫應(yīng)答方面，mRNA疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度是最高的，并且能持續(xù)至少一年不降低
 

　　在靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，編碼寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗，也產(chǎn)生了持續(xù)一年的高滴度抗體。
 

　　抗體親和力測定
 

　　由于Tfh細(xì)胞促進(jìn)親和力成熟，小鼠單次免疫HA mRNA疫苗后多克隆抗體的親和力是重要表征模型。而高滴度不一定意味著高親和力，所以在這篇文章中，作者使用賽多利斯Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)來檢測血清中多克隆抗體的親和力！首先使用AMC傳感器(anti-mouse IgG)固化血清中的抗體，與31.25nM的HA進(jìn)行結(jié)合解離，并用pH2.5的甘氨酸進(jìn)行再生，然后用1:1模型擬合獲得KD值(平衡解離常數(shù))。
 

　　在接種疫苗2周后，產(chǎn)生的抗體親和力隨著接種時(shí)間增加而增加，4周的時(shí)候KD值為362pM,8周的時(shí)候?yàn)?pM。相比之下，使用未修飾的mRNA或滅活的流感病毒顆粒免疫的小鼠中抗體的親和力低得多。Tfh細(xì)胞反應(yīng)通過體細(xì)胞超突變驅(qū)動(dòng)親和力成熟；但是需要進(jìn)一步對(duì)Ig可變基因進(jìn)行測序，并檢測純化的單克隆抗體的親和力。
 

　　圖4. Octet® 測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mRNA疫苗免疫時(shí)間越長，抗體親和力越高；縱坐標(biāo)為KD值(單位nM)
 

　　圖5. 相對(duì)于未修飾的mRNA疫苗(中)和滅活疫苗(右)，修飾的mRNA疫苗(左)的親和力最高
 

　　高親和力抗體的產(chǎn)生是中和多種病原體的基礎(chǔ)。這項(xiàng)研究證明了m1Ψ-mRNA-LNP疫苗能夠產(chǎn)生針對(duì)流感病毒、ZIKV和HIV-1的高滴度、高親和力和持續(xù)性中和抗體的能力。
 

　　輝瑞和BioNtech的 mRNA疫苗（BNT162b2）
 

　　卡里科博士作為BioNTech公司的高級(jí)副總裁，在新冠爆發(fā)后，帶動(dòng)了新冠mRNA疫苗的問世。
 

　　它是頭一個(gè)大規(guī)模使用的新冠mRNA疫苗。在其遞交給歐洲藥物管理局(EMA)的評(píng)估報(bào)告^[2]和發(fā)表的Nature研究性文章^[3]中均提到：
 

　　利用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)(BLI技術(shù))來測定mRNA表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合活性。通過生物傳感器分別固化ACE2和抗體，與293T細(xì)胞中表達(dá)的不同濃度的S蛋白(疫苗表達(dá)產(chǎn)物)進(jìn)行親和力測定。兩者的親和力均在nM級(jí)別，符合正常S蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力，并以此作為疫苗功能確認(rèn)的指標(biāo)之一。
 

　　在其公布臨床前研究中可發(fā)現(xiàn)，該疫苗編碼的是S蛋白，其中986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸，與野生型S蛋白相比，不會(huì)與細(xì)胞膜融合，維持了融合前構(gòu)象。該疫苗的表達(dá)產(chǎn)物保持了與受體ACE2以及一種RBD中和抗體的親和力。同時(shí)，還同時(shí)設(shè)計(jì)了其他序列，一起與BNT162b2平行比較，最終選擇了BNT162b2作為候選mRNA疫苗。
 

　　我們都知道，從分子生物學(xué)的角度來看，RNA是一種非常不穩(wěn)定的分子。然而，通過幾十年的技術(shù)積累，科學(xué)家們成功的將RNA做成一類疫苗，并在新冠疫情種拯救了數(shù)以千萬計(jì)的生命。這也就是為什么這次諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)眾望所歸的原因吧。
 

 

　　使用Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢？
 

　　· 非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，它的親和力測試結(jié)果更準(zhǔn)確

　　· 快速測定親和力，更加定量化對(duì)互作進(jìn)行表征

　　· 無洗滌步驟，可測弱親和力(解離快) 

　　· 測試時(shí)間短，一般10-20分鐘，更快拿到結(jié)果 

　　· 實(shí)驗(yàn)形式多樣化：定性，兩者結(jié)合，協(xié)同/競爭實(shí)驗(yàn)，垂釣 

　　· 寫入了美國藥典，文章多于13,000篇，認(rèn)可度廣 

　　· 萬金油技術(shù)，可以用于檢測DNA、小分子、蛋白等各種生物分子 

　　· 使用方便，成本相對(duì)低，對(duì)粗樣品耐受性好；比如本文就直接檢測小鼠血清抗體

　　· 通量大；本文就用Octet® 檢測了十幾個(gè)小鼠樣本(多濃度)

       -參考文獻(xiàn)-

         [1] Nucleoside-modified mRNA vaccines induce potent Tfollicular helper and germinal center B cell responses. J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 6 1571–1588
         [2] Procedure No. EMEA/H/C/005735/0000.
         [3] Vogel AB, Kanevsky I, Che Y, Swanson KA, Muik A, Vormehr M, Kranz LM, Walzer KC, Hein S, Güler A, Loschko J, Maddur MS, Ota-Setlik A, Tompkins K, Cole J, Lui BG, Ziegenhals T, Plaschke A, Eisel D, Dany SC, Fesser S, Erbar S, Bates F, Schneider D, Jesionek B, Sänger B, Wallisch AK, Feuchter Y, Junginger H, Krumm SA, Heinen AP, Adams-Quack P, Schlereth J, Schille S, Kröner C, de la Caridad Güimil Garcia R, Hiller T, Fischer L, Sellers RS, Choudhary S, Gonzalez O, Vascotto F, Gutman MR, Fontenot JA, Hall-Ursone S, Brasky K, Griffor MC, Han S, Su AAH, Lees JA, Nedoma NL, Mashalidis EH, Sahasrabudhe PV, Tan CY, Pavliakova D, Singh G, Fontes-Garfias C, Pride M, Scully IL, Ciolino T, Obregon J, Gazi M, Carrion R Jr, Alfson KJ, Kalina WV, Kaushal D, Shi PY, Klamp T, Rosenbaum C, Kuhn AN, Türeci Ö, Dormitzer PR, Jansen KU, Sahin U. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature. 2021 Apr;592(7853):283-289. doi: 10.1038/s41586-021-03275-y. Epub 2021 Feb 1. PMID: 33524990.